TЕМА 4. ФИЗИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ


Химический состав клеток прокариот

Ферменты прокариот

Факторы роста

Понятие о метаболизме

Брожение

Аэробное дыхание

Анаэробное дыхание

Особенности бактериального фотосинтеза


Химический состав клеток прокариот близок к таковому эукариот. Содержание воды в прокариотических клетках составляет 80–90 % от общей массы. Оставшиеся 10–20 % приходится на сухое вещество. В составе сухой массы клетки 50–80 % приходится на белки, до 16 % – на РНК, 3–4 % – на ДНК, 5–30 % – липиды, 10–30 % – углеводы, 1–14 % – на минеральные соединения.

Элементарный состав сухих веществ прокариотической клетки следующий: углерод – 50 %, кислород – 20 %, азот – 10–15 %, водород – 10 %, фосфор – 2–6 %, серу и другие элементы – 3–8 %. Для нормального роста и развития прокариот необходимы ионы металлов, представленные макроэлементами (калий, кальций, магний, железо) и микроэлементами (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель и др.).

Прокариоты различны по своим потребностям к веществам питательного субстрата.

Углерод входит в состав любого органического соединения прокариотной клетки. По источнику углерода для конструктивного обмена все прокариоты делятся на две группы: автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные прокариоты различаются по характеру источника энергии делятся на фототрофы и хемотрофы.

Гетеротрофные организмы могут выступать в роли сапрофитов, или паразитов. Для большинства гетеротрофов оптимальным и наиболее доступным источником углерода служат углеводы (особенно широко бактерии используют моносахариды – гексозы, некоторые пентозы). Источником углерода для бактерий могут служить многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты. Коринебактерии, микобактерии и псевдомонады потребляют восстановленные соединения углерода – углеводородов.

Миксотрофные организмы способны использовать одновременно различные источники энергии или синтезировать один и тот же компонент клеток из различных соединений углерода (некоторые серобактерии, водородные бактерии и др.).

Азот необходим для синтеза аминокислот, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Восстановленные формы азота бактерии используют в виде солей аммония и аммиака, реже органические азотсодержащие вещества – белки, аминокислоты, мочевину, разрушая их с выделением аммиака. Окисленные формы азота – нитриты, нитраты также усваиваются различными группами бактерий. Прокариоты-азотфиксаторы способны фиксировать молекулярный азот атмосферы для построения необходимых компонентов клетки.

Фосфор в клетках прокариот входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов, коферментов, АТФ. Источником фосфора для бактерий в основном служат фосфаты калия или натрия, а из органических соединений – нуклеиновые кислоты.

Сера в клетке прокариот в основном встречается в восстановленной форме и входит в состав аминокислот (цистеин), витаминов и коферментов (биотин, кофермент А и др.). Источником серы для большинства микроорганизмов служат сульфаты, которые в клетке восстанавливаются в сульфиды. Некоторые бактерии нуждаются в соединениях, содержащих серу в восстановленной форме, таких как сероводород, тиосульфат, цистеин и метионин.



Ферменты прокариот

Ферменты бактериальных клеток относятся к шести классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Некоторые ферменты состоят только из белка, другие состоят из апофермента – белка и кофермента – органической молекулы меньшей величины, обычно содержат фосфат. Состав клеточных ферментов относительно постоянен, определяется геномом клетки и является важным таксономическим признаком ранга семейства, рода или вида.

Прокариоты синтезируют эндоферменты (регулируют процессы внутри клетки) и экзоферменты (выделяются клеткой в окружающую среду). Например, эндофермент пируватдекарбоксилаза катализирует отщепление углекислого газа от пировиноградной кислоты; экзоферменты гидролазы, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред.

Различают конститутивные ферменты (их синтез происходит в течение всего клеточного цикла и концентрация в клетке примерно постоянна) и индуцибельные (их синтез инициируется соответствующим субстратом). Например, конститутивными являются ферменты гликолиза, индуцибельными – протеазы, амилаза и т. п.

Ферменты различаются специфичностью, числом субстратов, на которые они могут действовать. Некоторые ферменты абсолютно специфичны, например, фермент мальтоза расщепляет только мальтозу, а лактаза – только лактозу.

Активность ферментов регулируется физическими факторами (температурой, давлением, светом, магнитным полем, электрическими импульсами) и химическими факторами. Действие химических факторов, приводящее к изменению ферментативной активности, может проявляться в таких формах, как: связывание с активным центром; взаимодействие со специальными участками на поверхности молекулы, путем ковалентного обратимого связывания с ферментом определенной группировки.

Аллостерические ферменты – белки с высокой молекулярной массой, состоящие из нескольких субъединиц одного или разного типа. В первом случае каждая субъединица содержит каталитический и регуляторный (аллостерический) центры. Во втором – одни субъединицы обладают каталитической активностью, другие выполняют регуляторную функцию.

Каталитическая активность аллостерического фермента меняется в результате связывания с его регуляторным центром определенных метаболитов-эффекторов. Эффекторами могут быть субстраты, конечные продукты данного пути или конечные продукты родственных метаболических путей. Различают два типа эффекторов:

ингибитор – эффектор, который приводит к понижению каталитической активности фермента;

активатор – эффектор, который повышает каталитическую активность фермента.



Факторы роста– органические соединения, без которых рост и развитие бактерий не возможны. К таким соединениям относятся аминокислоты, пурины и пиримидины, витамины и др.

Прототрофные бактерии, или прототрофы, способны синтезировать в своей клетке данное соединение, являющееся фактором роста. Ауксотрофные бактерии, или ауксотрофы, характеризуются нарушением биосинтеза соединения – фактора роста. Ауксотрофы без наличия фактора роста не способны расти на минимальных питательных средах. Ауксотрофами также являются мутантные штаммы бактерий, нуждающиеся в факторах роста, не являющихся необходимыми для исходных штаммов дикого типа.

Бактерии могут быть ауксотрофными по отношению к тому или иному соединению или полиауксотрофными. Для идентификации ауксотрофности используют синтетические питательные среды, к которым добавляют факторы роста, и проверяют их способность расти на этих средах.

Прокариоты различаются по потребностям в факторах роста. Например, молочнокислые бактерии ауксотрофны по ряду аминокислот, золотистый стафилококк ауксотрофен по витамину В5, для пневмококков и гонококков фактором роста является парааминобензойная кислота.

Факторы роста необходимы бактериям в ничтожно малых концентрациях: аминокислоты – 20–50 мкг/мл, пурины и пиримидины – 10–20 мкг/мл, витамины – 0,2–50 мкг/мл.

У прокариот выделяют четыре основные физиологические группы питания:

фотолитоавтотрофы (цианобактерии, зеленые, серные пурпурные бактерии);

фотоорганоавтотрофы (некоторые пурпурные бактерии);

хемолитоавтотрофы (нитрифицирующие, тионовые, водородные бактерии; ацидофильные железобактерии);

хеморганогетеротрофы (аммонификаторы, азотфиксаторы, пектиноразрушающие, клетчаткоразрушающие, молочнокислые и др.).

Для характеристики этих групп используются одновременно три критерия: источник углерода (СО2 и органические соединения), источник энергии (свет или реакции окисления неорганических веществ) и донор электронов (неорганические соединения у литотрофов или органические соединения у органотрофов). Нередко один и тот же организм при изменении условий среды может переключаться с одного типа метаболизма на другой.




Понятие о метаболизме

Клеточный метаболизм20 складывается из потоков реакций энергетического и конструктивного метаболизма.

Энергетический метаболизм – это поток реакций, сопровождающийся мобилизацией энергии и преобразованием ее в электрохимическую или химическую (АТФ) форму, которая затем может использоваться во всех энергозависимых процессах.

Образование АТФ может происходить двумя способами:

1. Фосфорилирование в электронтранспортной цепи дыхания и фотосинтеза связано с мембранами, вследствие чего его называют мембранным фосфорилированием:



АДФ + Фн → АТФ



2. Фосфорилирование на уровне субстрата (характерно для процессов брожения), заключающееся в переносе фосфатной группы на АДФ от вещества, более богатой энергией, чем АДФ:



R–Ф + АДФ → *R + АТФ



Все окислительно-восстановительные реакции энергетического метаболизма у хемотрофных микроорганизмов можно разделить на три типа: брожение; аэробное дыхание, или аэробное окисление; анаэробное дыхание.

Конструктивный метаболизм – поток реакций, в результате которых за счет поступающих извне веществ осуществляется биосинтез вещества клеток. Этот процесс связан с потреблением свободной энергии, запасенной в химической форме в молекулах АТФ или других богатых энергией соединений.

Более 95 % клеточного материала микроорганизмов состоит из макромолекул или полимеров: белков, полисахаридов, липидов, РНК, ДНК. На долю белков приходится 52 %, а на долю нуклеиновых кислот – 19 % массы сухого вещества. Около 3 % сухого вещества клеток составляют низкомолекулярные органические соединения и соли.

Образованию полимеров из глюкозы предшествует синтез составляющих их мономеров: в случае полисахаридов – различных моносахаридов, в случае нуклеиновых кислот – рибо- и дезоксирибонуклеотидов, в случае белков – аминокислот и т. д.

Мономеры синтезируются из промежуточных метаболитов (амфиболитов), которые образуются при катаболизме глюкозы. Такими промежуточными метаболитами являются пентозофосфаты, фосфоенолпируват, пируват, ацетил-КоА, щавелевоуксусная и α-кетоглутаровая кислоты. Они являются исходным материалом для синтеза всех необходимых клетке аминокислот, витаминов, сахарофосфатов, жирных кислот, рибо- и дезоксирибонуклеотидов, которые образуются в реакции полимеризации.

Процессы биосинтеза разнообразных веществ, роста, размножения, поглощения и выделения веществ, движения и т. д. происходят за счет энергии, аккумулированной в макроэргических связях АТФ.

По отношению к энергетическим источникам все микроорганизмы подразделяются на две группы: хемотрофные и фототрофные. Хемотрофные микроорганизмы используют для синтеза молекул АТФ энергию, освобождаемую в результате химических реакций, фототрофные – световую энергию в процессе протекания фотосинтеза.



Брожение – это способ получения энергии, при котором АТФ образуется в результате анаэробного окисления органических субстратов в реакциях субстратного фосфорилирования. При брожении продукты расщепления одного органического субстрата могут одновременно служить и донорами, и акцепторами электронов. Сбраживанию могут подвергаться различные субстраты, но лучше других используются углеводы. АТФ при брожении синтезируется в результате реакций субстратного фосфорилирования.

Процесс брожения состоит из двух этапов: окислительного, при котором органический субстрат окисляется до пировиноградной кислоты, и восстановительного, при котором пировиноградная кислота восстанавливается до конечных продуктов, характер которых определяет тип брожения (маслянокислое, молочнокислое, спиртовое и др.).

Окислительный этап упрокариот может осуществляться несколькими путями (рисунок 2.12), ведущими к расщеплению сахаров до ПВК:

1. Гликолиз, или фруктозодифосфатный путь, или путь Эмбдена –
Мейергофа – Парнаса
(ЭМП) (рисунок 15). Это основной способ расщепления сахаров, встречающийся у разных групп бактерий. Процесс состоит из многих биохимических реакций, общее уравнение которых может быть записано следующим образом:


СбН12О6 + 2АДФ + 2Фн + 2 НАД → 2С3Н4О3 + 2АТФ + 2НАД·H2.



Рисунок 15 – Схема гликолиза


Таким образом, при распаде одной молекулы гексозы образуются четыре молекулы АТФ, в которых аккумулируется освободившая при гликолизе энергия. Поскольку в самом начале процесса на активирование гексозы были израсходованы две молекулы АТФ, то конечный выход АТФ на одну молекулу глюкозы составит две молекулы.

2. Пентозофосфатный путь, или фосфоглюконановый цикл, протекает с образованием гексозомонофосфатов и пентозофосфатов, а также с использованием peaкций гликолиза для превращения 3-фосфо-глицеринового альдегида в пируват (рисунок 16).

Пентозофосфатный цикл представляет собой дополнительный путь, который служит источником НАДФ·Н2 и пентоз для конструктивного обмена, в основном для синтеза нуклеотидов.


Рисунок 16 – Схема пентозофосфатного пути


3. 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь, или путь Энтнера -Дудорова, отличается от пентозофосфатного тем, что 6-фосфоглюконовая кислота под действием фосфоглюконатдегидратазы превращается в 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовую кислоту, которая специфической альдолазой расщепляется на пировиноградную кислоту и 3-ФГА. Последний может превращаться в пировиноградную кислоту гликолитическим путем с образованием двух молекул АТФ и одной молекулы НАД·Н2 или НАДФ·Н2, как и при пентозофосфатном пути, фактический энергетический выход составляет одну молекулу АТФ (рисунок 17).


Рисунок 17 – Схема пути Энтнера-Дудорова


Все перечисленные пути катаболизма глюкозы у микроорганизмов могут протекать при разных типах энергетического метаболизма (аэробное дыхание, анаэробное дыхание, брожение).

Два первых пути распада углеводов (гликолиз и пентозофосфатный цикл) функционируют у большинства аэробных и анаэробных микроорганизмов. Например, маслянокислое брожение, гомоферментативное молочнокислое брожение, сбраживание сахаров дрожжами до пирувата идет по гликолитическому пути, а у гетероферментативных бактерий превращение углеводов происходит по пентозофосфатному пути.

Путь Энтнера – Дудорова менее распространен; он обнаружен у бактерий из родов Pseudomonas, Azotobacter, Rhizobium, Spirillum и некоторых других. По-видимому, этот путь сформировался позднее гликолитического и пентозофосфатного путей и возник как ответвление последнего. Важнейшим продуктом, образующимся при любом из трех описанных путей расщепления углеводов, является пировиноградная кислота, которая подвергается дальнейшему превращению (рисунок 18).


Рисунок 18 – Пути катаболизма глюкозы в клетках прокариот (по В.В. Лысаку):

А гликолиз; Б путь Энтнера – Дудорова; Впентозофосфатный путь


Далее при сбраживании углеводов и ряда других веществ (по отдельности или в смеси) пировиноградная кислота восстанавливается до таких продуктов, как этанол, молочная, муравьиная, янтарная кислоты, ацетон, СО2, Н2 и др. В зависимости от того, какие продукты преобладают или являются особенно характерными, различают спиртовое, молочнокислое, муравьинокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие типы брожения.

Органические вещества, являющиеся конечными продуктами брожений, содержат значительный запас химической энергии. В связи с этим энергетический выход при брожении гораздо ниже, чем при дыхании.

Различают два типа молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное. При гомоферментативном молочнокислом брожении синтезируется практически одна молочная кислота (примерно 90 % всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы в этом случае происходит по гликолитическому пути. Образующаяся при этом пировиноградная кислота не подвергается декарбоксилированию, а под действием лактатдегидрогеназы восстанавливается до молочной кислоты. Конечным акцептором водорода выступает пировиноградная кислота. Гомоферментативное молочнокислое брожение идет по следующему суммарному уравнению:



С6Н12О6 → 2СН3–СНОН–СООН + 75,6 кДж



Возбудителями гомоферментативного молочнокислого брожения являются, например, бактерии Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis и др.

Гетероферментативное молочнокислое брожение приводит к образованию разнообразных продуктов: молочной и уксусной кислот, этилового спирта, углекислого газа и глицерина. При этом типе брожения расщепление углеводов происходит по пентозофосфатному пути. Конечными акцепторами водорода являются пировиноградная кислота и ацетальдегид. Гетероферментативное молочнокислое брожение идет по следующему суммарному уравнению:



С6Н12О6 → СН3–СНОН–СООН + С2Н5ОН + СО2



Возбудителями гетероферментативного молочнокислого брожения являются бактерии видов Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus brevis и др.

Все молочнокислые бактерии анаэробы, но могут развиваться в присутствии кислорода. Молочнокислые бактерии обладают чрезвычайно ограниченными синтетическими возможностями: не способны синтезировать витамины группы В, большинство аминокислот, источником которых для них является молоко. Они обладают высокой кислотоустойчивостью (рН 5–6) и солеустойчивостью.

Молочнокислые бактерии очень широко распространены в природе. Они всегда имеются в почве, на поверхности растений, и это является источником их постоянного появления в молочных и других продуктах.

В промышленности используют культурные расы бактерий, которые имеют ряд преимуществ перед дикими формами. Молочнокислые бактерии находят широкое применение в различных отраслях хозяйственной деятельности человека в процессе приготовления кисломолочных продуктов, сырокопченых колбас, квашения овощей и фруктов, в хлебопечении, для силосования кормов, биологической выделки кож и т. п. Они входят в состав нормальной микрофлоры человека и животных. Многие представители патогенны.

Маслянокислое брожение проходит в строго анаэробных условиях, и осуществляют его облигатно анаэробные бактерии рода Clostridium. В основе брожения лежит сбраживание углеводов по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты, которая далее подвергается декарбоксилированию с образованием ацетил-КоА. Основной продукт брожения – масляная кислота – синтезируется в результате конденсации двух молекул ацетил-КоА. Превращение ацетил-КоА в масляную кислоту сопряжено с процессами восстановления, в которых в качестве доноров водорода используются молекулы НАД·Н2, образующиеся ранее в процессе гликолиза. Кроме того, одна из молекул ацетил-КоА, присоединяя неорганический фосфат, может подвергаться фосфорилированию, превращаясь в ацетилфосфат и далее в ацетат, что сопровождается синтезом АТФ при субстратном фосфорилировании. Это третья молекула АТФ, которая синтезируется при маслянокислом брожении (две другие молекулы АТФ образуются при расщеплении глюкозы по гликолитическому пути).

Схематично процесс может быть изображен в виде следующего уравнения:



С6Н12О6 → СН3–СН2–СН2–СООН + 2СО2 + 2Н2 + 495 кДж



Маслянокислые бактерии имеют различные активные ферменты, способные производить расщепление сложных углеводов. Образующаяся масляная кислота в невысоких концентрациях является веществом, стимулирующим рост высших растений.

В зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения маслянокислые бактерии подразделяют на:

– сахаролитические виды, сбраживающие растворимые углеводы, крахмал или пектин (Clostridium pasteurianum, Cl. butylicum, Cl. acetobutylicum и др.);

– протеолитические виды, сбраживающие аминокислоты (Cl. sporogenes, Cl. histolyticum, Cl. botulinum и др.);

– виды, сбраживающие азотсодержащие циклические соединения –пурины и пиримидины (Cl. acidiurici, Cl. cylindrosporum).

Маслянокислое брожение имеет практическое применение для получения масляной кислоты, используемой в парфюмерной промышленности. Для ее производства используют картофель, зерно, мелассу (отходы сахарного производства). Маслянокислые бактерии нередко причиняют вред, вызывая порчу продуктов (прогоркание масла, сметаны, квашеных овощей, силоса), а также при недостаточной стерилизации – порчу консервированных грибных и мясных продуктов.

Процесс спиртового брожения идет по следующему суммарному

уравнению:



С6Н12O6 + 2АДФ + 2Фн → 2СН3СН2ОН + 2СО2↑ + 2АТФ



Из уравнения видно, что один продукт брожения (этанол) является более восстановленным, а другой (СО2) – более окисленным, чем глюкоза. Кроме этанола и углекислоты при брожении нередко в небольшом количестве образуются побочные продукты: амиловый и бутиловый спирты (сивушные масла), глицерин и некоторые другие. Выход АТФ составляет 2 моля на 1 моль глюкозы.

Главными возбудителями спиртового брожения являются некоторые виды дрожжей – одноклеточных грибов, размножающихся почкованием или делением. Дрожжи – факультативные аэробы, осуществляющие в присутствии молекулярного кислорода аэробное дыхание, а в анаэробных условиях – брожение. Кроме дрожжей возбудителями спиртового брожения являются также некоторые виды бактерий (Zymomonas mobitis, Sarcina ventriculi, Erwinia amylovora).

Лучше всего процесс спиртового брожения изучен у дрожжей, которые сбраживают углеводы, имеющие 3, 6 или 9 атомов углерода. Они способны использовать и дисахара, например, сахарозу, предварительно вызывая ее гидролитическое расщепление на глюкозу и фруктозу. Дрожжи не вырабатывают амилазу. Поэтому при использовании в качестве сырья для брожения крахмалистых материалов (зерна, картофеля) нужно добавлять солод, т.е. измельченные проросшие зерна ячменя, которые содержат активную амилазу. Вместо солода можно использовать чистый препарат амилазы.

Наиболее активно спиртовое брожение протекает в кислой среде при pH 4,0–5,0. Среда элективна за счет накопления этилового спирта, концентрация которого в среде может достигать 12–15 %. В дальнейшем процесс брожения прекращается из-за угнетения дрожжей продуктами их собственной деятельности.

Сбраживание сахаров дрожжами идет по пути гликолиза. Пиро-виноградная кислота под действием пируватдекарбоксилазы в присутствии тиаминпирофосфата распадается на уксусный альдегид и СО2. Затем ацетальдегид восстанавливается НАД·Н2-алкогольдегидрогеназой до этанола, при этом используется водород, отщепляемый при окислении фосфоглицеринового альдегида.

При изучении спиртового брожения Л. Пастером было открыто явление ингибирования данного процесса в присутствии кислорода, получившее название эффекта Пастера. Биологический смысл эффекта Пастера понятен: дыхание дает гораздо больше энергии, чем брожение, поэтому для получения такого же количества АТФ требуется меньше гексозы. При доступе кислорода НАД·Н2 окисляется в электронтранспортной цепи и не используется на восстановление уксусного альдегида. Кроме того, может происходить конкуренция за АДФ и неорганический фосфат между процессами субстратного фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи, вследствие чего весь процесс брожения замедляется. В бродильном производстве необходимо учитывать эффект Пастера и добиваться как можно более полного исключения кислорода, который тормозит образование спирта.

Спиртовое брожение широко используется для получения технического спирта, вина, пива, а также в хлебопечении. В последнем случае имеет значение не спирт, а углекислый газ, который образуется в большом количестве (около 45 л на 180 г глюкозы) и вызывает разрыхление и подъем теста. Наибольшее применение в промышленности находят Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini, Schizosaccharomyces pombe.

Аэробное дыхание

Процесс аэробного дыхания с использованием органических субстратов состоит из трех этапов:

1) анаэробное расщепление простых сахаров с образованием пировиноградной кислоты;

2) окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты;

3) цикл лимонной кислоты, или цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), или цикл Кребса.

Все три этапа включают реакции отщепления водорода и электронов, катализируемые соответствующими дегидрогеназами, входящими в состав электронтранспортной цепи.

Пировиноградная кислота, образующаяся в одном из трех путей катаболизма глюкозы (рисунок 18), подвергается декарбоксилированию и окисляется с участием коэнзима А до ацетил-КоА, который затем включается в цикл Кребса (рисунок 19):



СНзСОСООН + НАД+ + КоА-SH→ СНзСО~SКоА + СО2 + НАД·Н2



Суммарное уравнение цикл Креба можно записать следующим образом:



CH3CO~SKоA + 3H2O→2СО2+ 4 [Н2] + KoA-SH



Рисунок 19 – Общая схема цикла Кребса


В цикл включается одна молекула ацетил-КоА, соединяясь с оксалоацетатом. При полном обороте цикла происходит присоединение трех молекул Н2О, отщепление двух молекул СО2 и четырех пар атомов водорода. При окислении изолимонной кислоты водород присоединяется к НАД или НАДФ, α-кетоглутаровой и яблочной – к НАД, а при окислении янтарной кислоты – к ФАД.

Кроме того, при превращении α-кетоглутарата в сукцинат с участием α-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса и сукцинил-КоА-синтетазы в результате фосфорилирования на уровне субстрата образуется молекула макроэргического соединения – гуанозинтрифосфата (ГТФ), используемого в дальнейшем на синтез АТФ:





ГТФ + АДФ → ГДФ + АТФ




Цикл Кребса может функционировать не только в энергетическом обмене аэробных организмов, но одновременно и в конструктивном обмене.

Главное отличие аэробного дыхания от брожения заключается в том, что при брожении конечными акцепторами электронов служат органические вещества (пировиноградная кислота или продукты eе превращений), а при дыхании – молекулярный кислород.

Электроны поступают в дыхательную цепь, которая состоит из переносчиков водорода и электронов НАД, ФАД, ФМН, убихиона, цитохромной системы. В цепи выделяют четыре основных структурно обособленных комплекса, которые функционально связны между собой: НАД и ФМН (НАД·Н2-дегидрогеназа); сукцинатдегидрогеназа и ФАД; цитохром b и цитохром с; цитохромы а и а3.

По мере продвижения по цепи электроны теряют свободную энергию, изменения которой достаточно для синтеза трех молекул АТФ из АДФ и неорганического фосфата. На трех участках в дыхательной цепи. Происходит сопряжение окисления и фосфорилирования: от НАД до ФМН; от убихинона до цитохрома с; от цитохрома с до О2.

Согласно хемиосмотической гипотезе, перенос электронов сопровождается выкачиванием ионов Н+ через мембрану в наружную водную среду. Вследствие этого между наружной и внутренней сторонами мембраны возникает градиент концентрации ионов Н+ – трансмембранный электрохимический градиент ионов водорода. Энергия трансмембранного электрохимического градиента используется для синтеза АТФ. Этот синтез катализирует АТФ-синтетазный комплекс, который обеспечивает сопряжение процессов окисления и фосфорилирования.

Укороченные дыхательные цепи очень характерны для бактерий, у которых встречается большое разнообразие систем переноса электронов. Обнаружены переносчики электронов, которые не встречаются у других организмов: менахинон (витамин К), цитохромы d, с4, с5 и др. Последовательность расположения переносчиков может изменяться.

Аэробный распад одной молекулы гексозы при функционировании полной дыхательной цепи приводит к образованию 38 молекул АТФ: 2 при гликолизе, 2 в двух циклах Кребса на уровне субстратов и 34 путем окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. Суммарное уравнение аэробного дыхания следующее:



С6Н12О6 + 6О2 + 38АДФ + 38Н3РО4 → 6СО2 + 38АТФ + 44Н2О



Анаэробное дыхание

Анаэробным дыханием называют процесс окисления органических соединений или молекулярного водорода, при котором конечным акцептором электронов в электронтранспортной цепи являются неорганические или органические соединения, но не молекулярный кислород. Если конечными акцепторами электронов служат NО3 или
2, то процесс называется нитратным дыханием, или денитрификацией; если SО42– – сульфатным дыханием или сульфатредукцией; если СО2 – карбонатным дыханием; если фумаровая кислота – фумаратным дыханием. Все бактерии, способные к анаэробному дыханию, имеют элементы электронтранспортной цепи, причем АТФ образуется в процессе мембранного фосфорилирования.

По отношению к молекулярному кислороду эти бактерии являются факультативными или облигатными анаэробами. В присутствии кислорода в среде у факультативных анаэробов происходит процесс аэробного дыхания, в отсутствие молекулярного кислора они используют другие конечные акцепторы электронов. Лучше других изучены процессы денитрификации и сульфатредукции.

Нитратное дыхание, или денитрификация, называется микробиологический процесс восстановления нитратов до газообразных продуктов (N2, NО или N2O), при этом конечными акцепторами электронов служат NО3 или NО2. Процесс имеет энергетическое значение для осуществляющих его бактерий. К денитрификации способны только прокариоты, представители рода Pseudomonas – грамотрицательные подвижные палочки, родов Neisseria и Paracoccus – грамотрицательные кокки, рода Bacillus – грамположительные спорообразующие палочки и др. Эти бактерии являются факультативными анаэробами. В присутствии молекулярного кислорода они осуществляют аэробное дыхание, используют в качестве конечного акцептора электронов кислород воздуха. При хорошем доступе кислорода денитрификации не происходит. В анаэробных условиях большинство денитрифицирующих бактерий, в отличие от других факультативных анаэробов, не переходят к осуществлению брожения, а продолжают процесс дыхания.

Суммарное уравнение реакции нитратного дыхания, где окисляемым субстратом является глюкоза, а конечным акцептором электронов – цитраты, следующее:



С6Н12О6 + 4NО3→ 6СО2 + 6H2O + 2N2 + Q



Подавляющее большинство денитрификаторов – хемоорганогетеротрофы, использующие в качестве окисляемого субстрата углеводы, спирты, органические кислоты и другие органические соединения. Восстановление нитратов протекает в несколько этапов: вначале образуется нитрит, затем окись азота, далее закись азота и, наконец, молекулярный азот:



NO3→NO2→NО↑→ N2О↑→N2



У денитрифицирующих бактерий функционирует электронтранспортная дыхательная цепь (полная – при аэробном дыхании и укороченная – при анаэробном). Нитратредуктаза, получив электрон от цитохрома b, восстанавливает NО3 до NО2. Нитритредуктаза и редуктазы окиси и закиси азота сопряжены с электронтранспортной цепью на уровне цитохрома b.

Энергетически выход процесса денитрификации составляет 70 % по сравнению с аэробным дыханием, т.е. приблизительно 2 молекулы АТФ.

Процесс денитрификации происходит обычно в плотных и заболоченных почвах и может привести к обеднению почвы азотом. При хорошей аэрации денитрификация прекращается, т.к. молекулярный кислород вступает в конкуренцию с нитратами за электроны дыхательной цепи и подавляет деятельность нитратредуцирующей системы ферментов. Денитрифицирующие бактерии являются важным звеном в круговороте азота в природе, обогащая атмосферу молекулярным азотом. Кроме того, эти бактерии играют положительную роль в освобождении подземных вод и почв от накопившихся в результате деятельности человека (внесение высоких доз удобрений, промышленные стоки) нитратов и нитритов.

Карбонатное дыхание – процесс окисления молекулярного водорода, при котором конечным акцептором электронов является СО2:



2 + СО2 → СН4 + 2Н2О



Карбонатное дыхание осуществляют метаногенные бактерии из класса архебактерий. Все они строгие анаэробы, способны образовывать метан, не имеют ацетилмурамовой кислоты и D-аминокислот в клеточных стенках, их цитоплазматическая мембрана содержит липиды, представленные простыми эфирами глицерина и терпеноидных спиртов, механизм трансляции у них нечувствителен к антибиотикам. Встречаются мезофильные и термофильные виды. Обитают в иловых отложениях водоемов, в болотах, на заболоченных почвах, в осадочных слоях морей и океанов. Метаногенные бактерии – типичные обитатели пищеварительного тракта животных и человека и важный компонент микрофлоры рубца жвачных животных. Метаногенные бактерии участвуют в разложении органических веществ в отстойниках сточных вод при биологической очистке, в переработке экскрементов животных вместе с отбросами, содержащими целлюлозу, в навозных ямах.

Кроме Н2 и СО2, многие метаногенные бактерии могут использовать для получения энергии формиат, метанол, ацетат, а также метилированные амины. Например:



4СН3NH3 + 2H2O→ 3CH4 + CO2 + 4NH4+



Получение энергии связано с функционированием электронтранспортной цепи, в которой присутствуют дегидрогеназы или гидрогеназы, переносчики электронов и редуктазы. Редуктазы связаны с переносчиками дыхательной цепи. Переносчики электронов метаногенных бактерий содержат в качестве коферментов и простетических групп соединения, найденные только у представителей этой группы: фактор F420, кофермент М (2-меркаптоэтанолсульфат), тетрагидрометаноптерин, метанофуран, фактор F430 и др. При восстановлении СО2 до метана запасается энергия в форме электрохимического ионного потенциала. Фосфорилирование на субстратном уровне у метаногенных организмов отсутствует. Количество образуемой энергии непосредственно зависит от изменяющихся в природных условиях концентраций молекулярного водорода.

Сульфатное дыхание, или диссимиляционная сульфатредукция, характерно для бактерий, способных окислять органические соединения или молекулярный водород в анаэробных условиях, используя в качестве акцепторов электронов в дыхательной цепи сульфаты. Кроме сульфатов конечными акцепторами электронов могут служить и другие соединения серы: тиосульфат и сульфит ионы, молекулярная сера. Сульфатвосстанавливающие бактерии относятся к родам Dеsulfovibrio, Dеsulfotomacutum, Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema и т.д.

Все сульфатредуцирующие бактерии – строгие анаэробы. Подавляющее большинство бактерий этой группы хемоорганогетеротрофы. Источником углерода и энергии для них являются простые органические вещества – пируват, лактат, сукцинат, малат, а также некоторые спирты. У бактерий родов Desulfovibrio и Dеsulfomonas окисление органических веществ идет обычно не до конца. Так, при окислении молочной, фумаровой и янтарной кислот образуется уксусная кислота, окисляемым субстратом является молекулярный водород.

Бактерии этой группы способны также получать энергию за счет окисления молекулярного водорода, сопряженного с восстановлением сульфатов:



4H2 + H24→H2S + 4H2O



Сульфатвосстанавливающие бактерии распространены в анаэробных зонах соленых озер и морских лиманов, в илах, почве. Являясь основными продуцентами сероводорода, сульфатредуцирующие бактерии могут приносить вред, вызывая коррозию металлических труб и других подводных подземных сооружений, а также замор рыбы в водоемах.

Фумаратное дыхание отличается от всех описанных ранее способов анаэробного дыхания: во-первых, это единственный пример, когда роль конечного акцептора электронов в дыхательной цепи играет органическое вещество (фумаровая кислота); во-вторых, этот способ запасания энергии не является самостоятельным (единственным) для какой-либо таксономической группы бактерий. Во всех известных случаях бактерии, способные осуществлять фумаратное дыхание, являются хемоорганотрофами и обладают способностью к брожению. Таким образом, использование фумарата в качестве акцептора электронов при дыхании является лишь дополнительным механизмом, позволяющим бактериям добывать повышенное количество энергии в анаэробных условиях.

Процесс восстановления фумарата в бактериальных клетках часто сопровождается образованием сукцината, который может выделяться в среду в довольно больших количествах. Поэтому осуществляющие его бактерии называют сукциногенными. К ним относят, в первую очередь, некоторые виды родов Bacteroides, Fibrobacter, Wolinella. Все они являются микроаэрофилами, способными к аэробному дыханию при низких концентрациях кислорода, но в отсутствие О2 могут использовать альтернативный акцептор электронов – фумарат.

Кроме сукциногенных бактерий к фумаратному дыханию способны многие другие хемоорганотрофы, но их метаболизм не сопровождается выделением заметных количеств янтарной кислоты. К числу таких микроорганизмов можно отнести энтеробактерии (роды Escherichia, Proteus, Salmonella, Klebsiella и др.), представителей рода Propionibacterium. Все перечисленные виды добывают энергию в анаэробных условиях в процессах брожения. При этом пропионовокислые бактерии в ходе брожения осуществляют этап фумаратного дыхания. Для перечисленных бактерий добавление фумарата к питательной среде значительно улучшает рост, что связано с увеличением эффективности синтеза АТФ за счет окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи при восстановлении фумарата.



Особенности бактериального фотосинтеза.

Основную массу фототрофов составляют водоросли, высшие растения и цианобактерии. Значительно меньшая доля приходится на пурпурные и зеленые бактерии, прохлорофиты и галобактерии. Различают аноксигенный и оксигенный фотосинтез.

Аноксигенный фотосинтез осуществляется пурпурными бактериями, зелеными бактериями. Процесс происходит при участии бактериохлорофиллов и не сопровождается выделением молекулярного кислорода. Источником углерода при аноксигенном фотосинтезе может служить двуокись углерода или органические соединения. В качестве доноров электронов используются минеральные вещества или органические вещества. Процесс ассимиляции углекислоты, осуществляемый разными фотоавтотрофными эубактериями, выражается следующим общим уравнением:



СО2 + 2Н2А → (СН2О)+Н2О + 2А,


где Н2А – экзогенный донор водорода; (СН2О) – образующееся органическое вещество


Фототрофныс пурпурные и зеленые бактерии обитают в анаэроб-

Первичным продуктом преобразования световой энергии в химическую является АТФ.

Пурпурные и зеленые бактерии содержат пигменты, очень близкие по структуре к хлорофиллу растений; они получили название бактериохлорофиллов а, b, с, d, е. В клетках большинства пурпурных бактерий основным пигментом является бактериохлорофилл а, отличающийся от хлорофилла а тем, что в его первом пиррольном кольце присутствует ацетильная группа –СО–СН3 вместо винильной –СН=СН2, а второе кольцо восстановлено (рисунок 20).


Рисунок 20 – Структура молекул фотосинтетических пигментов


В клетках некоторых пурпурных бактерий в качестве основного пигмента обнаружен бактериохлорофилл b. У зеленых бактерий преобладают бактериохлорофиллы с, d или е, которые этерифицированы не фитолом (С20Н39ОН), а фарнезолом (С15Н25ОН) или другим многоатомным спиртом. Кроме того, в клетках всех зеленых бактерий в небольших количествах содержится бактериохлорофилл а. Набор пигментов является специфичным для каждой группы бактерий.

Пигменты фотосинтезирующих бактерий поглощают свет в широком диапазоне длин волн. Интересной особенностью бактериохлорофиллов является способность поглощать инфракрасные лучи: максимум поглощения в длинноволновой части спектра у бактериохлорофиллаа находится при длине волны 850–890 нм, бактериохлорофилла b – 720–740 нм, бактериохлорофилла с – 750–760 нм, бактериохлорофилла d – 720–740 нм, бактериохлорофилла е – 715–725 нм.

В клетках фотосинтезирующих прокариот содержатся также различные каротиноиды, придающие клеткам пурпурную, коричневую, розовую или оранжевую окраску. Пурпурные бактерии содержат большие количества каротиноидов, у зеленых бактерий этих пигментов значительно меньше, однако известны «зеленые» бактерии, принадлежащие к семейству Chlorobiaceae, коричневого цвета. У разных видов фототрофных бактерий обнаружено около 20 различных каротиноидов. Каротиноиды поглощают световую энергию в области 400–550 нм, 30–90 % которой передают на бактериохлорофилл, а также защищают клетки от фотоокисления.

В клетках фототрофных бактерий нет пластид, их функции выполняет цитоплазматическая мембрана. У пурпурных бактерий в участки ЦПМ в виде пузырьков, стопок, ламелл встроены пигменты в комплексе с белками. У зеленых бактерий бактериохлорофилл а, каротиноиды, связанные с белками, локализованы в ЦПМ. К этим участкам мембраны примыкают хлоросомы, в которых содержатся бактериохлорофиллы с, d или е. В ЦПМ встроены электронтранспортные системы, содержащие белки-переносчики.

Фотосинтетический аппарат пурпурных и зеленых бактерий, осуществляющий световую фазу фотосинтеза, состоит из фотосинтетических пигментов, фотохимических реакционных центров, электронтранспортных систем. При аноксигенном фотосинтезе фотосинтетический аппарат содержит одну фотосистему (ФС-I).

Основная масса молекул пигментов играет роль антенн, поглощающих свет. В фотохимической реакции принимают участие молекулы пигмента (Р) бактериохлорофилла а, входящие в состав реакционных центров. Это пигмент Р840 у зеленых серобактерий и пигменты Р870 и Р960 – у пурпурных бактерий.

Поглощенный квант света переводит молекулу пигмента антенны в возбужденное состояние, связанное с переходомэлектрона на более высокий энергетический уровень. Энергия поглощенного кванта может передаваться другой, рядом расположенной молекуле пигмента резонансным путем, возбуждая последнюю. Миграция энергии происходит от пигментов, поглощающих свет более коротких волн, к пигментам, поглощающим более длинные волны, до молекулы реакционного центра (например, у пурпурных бактерий, содержащих бактериохлорофилл а – Р870). Далее высокоэнергетический электрон передается от возбужденной молекулы бактериохлорофилла реакционного центра первичному акцептору электронов, функцию которого могут выполнять хинон в комплексе с железом у пурпурных бактерий, и FeS-содержащие белки у зеленых бактерий. Электронтранспортная цепь состоит из хинонов и цитохромов, последним из которых в цепи является цитохром с. Электрон от последнего переносчика возвращается на пигмент. Возникающий при фотосинтетическом электронном транспорте трансмембранный электрохимический градиент протонов пользуется для синтеза АТФ (процесс фотофосфориллирования). Перенос электронов от молекулы пигмента через электронтранспортную цепь и вновь к пигменту называется циклическим.

У пурпурных бактерий функционирует только процесс циклического транспорта электронов, который не приводит к образованию восстановителя (НАД·Н2), необходимого для процесса ассимиляции СО2. У этих бактерий восстановление НАД не связано непосредственно с обратным транспортом электронов от убихинона через флавопротеиды на НАД или ферредоксин. Экзогенным донором электронов служат H2S или Н2. Процесс обратного переноса электронов идет с затратой энергии трансмембранного потенциала.

У зеленых серобактерий кроме циклического транспорта электронов может функционировать нециклическая цепь. При нециклическом потоке часть электронов передается от первичного акцептора на ферредоксин и далее на НАД, который приобретает способность присоединять протоны:



НАД + 2ē + 2Н+→ НАД·Н2



«Электронная» дырка, возникшая при фотоокислении бактериохлорофиллов, заполняется электроном от цитохрома, который, в свою очередь, восстанавливается за счет какого-либо экзогенного донора электронов, напримерсероводород, тиосульфат, водород и т.д. (рисунок 21).


Рисунок 21 – Организация фотосинтетического аппарта зеленых серобактерий:

→ – циклический транспорт электронов; --- – нециклический транспорт электронов


Ассимиляция СО2 происходит в темновой фазе фототосинтеза –
в цикле Кальвина, где используются восстановленный НАД·Н2 и синтезированные путем фотофосфориллирования молекулы АТФ. У зеленых бактерий (например, у рода Chlorobium) вместо цикла Кальвина функционирует восстановительный цикл трикарбоновых кислот.

Оксигенный фотосинтез осуществляют цианобактерии и прохлорофиты. Этот процесс происходит при участии хлорофилла а и сопровождается выделением О2 в результате фотоокисления воды. Основным источником углерода при оксигенном фотосинтезе является СО2, донором электронов – Н2О. Этот тип фотосинтеза характерен для зеленых растений, цианобактерий и прохлорофитов. Цианобактерии в качестве источника углерода могут использовать и органические вещества. Общее уравнение оксигенного фотосинтеза следующее:



6СО2 + 12Н2О → С6Н12О6 + 6О2 + 6Н2О



В пигментной системе цианобактерий присутствуют хлорофилл а, каротиноиды и фикобилипротеиды, хромофорная группа которых состоит из четырех пиррольных колец, соединенных в виде открытой цепи, фикоцианин, аллофикоцианин и фикоэритрин. Фикоцианин и аллофикоцианин имеют голубой цвет, а фикоэритрин – красный. Если в клетках преобладает фикоцианин, то цианобактерии имеют сине-зеленую окраску, особенно яркую у видов, не содержащих фикоэритрина. Клетки, богатые фикоэритрином, бывают окрашены в красный, фиолетовый или коричневый цвет.

Хлорофилл, каротиноиды, а также реакционные центры и электронтранспортные системы фотосинтеза локализованы в мембранах тилакоидов, фикобилипротеиды сосредоточены в фикобилисомах – небольших тельцах, прикрепленных к внешней поверхности тилакоидов.

Для прохлорофитов характерно наличие хлорофиллов а и b и отсутствие фикобилинов. Представитель этой небольшой группы Prochloron didemni, имеющий крупные (диаметром 6–25 мкм) шаровидные клетки, является симбионтом колониальных морских низших хордовых животных асцидий. В настоящее время существует гипотеза, согласно которой прохлорофиты являются предшественниками хлоропластов зеленых растений.

Хлорофиллы клеток цианобактерий и прохлорофитов поглощают свет с длиной волны до 750 нм.

У цианобактерий имеется развитая система внутриклеточных мембран – тилакоидов, к которым примыкают гранулы – фикобилисомы. Форма, размер и число гранул у разных видов цианобактерий различны. Фикобилисомы могут иметь форму полусферы или цилиндра. Фотохимические реакционные центры и электронтранспортные системы сосредоточены в основном в тилакоидах.

При оксигенном фотосинтезе фотосинтетический аппарат содержит две фотосистемы (ФС-I и ФС-II). Функционирование их характерно для растений, цианобактерий и прохлорофитов. Возбуждение ФС-I обусловливает циклический поток электронов, сопряженный с синтезом АТФ. Функционирование ФС-II позволяет в качестве донора электронов использовать воду. Вода подвергается фотоокислению по формуле:



2О → 4Н+ + 4ē + 4ОН;


4ОН→ Н2О + О2



Освобождающиеся электроны через переносчика ФС-II передаются на ФС-I, где происходит восстановление НАДФ+. Нециклический поток электронов также сопряжен с синтезом АТФ. «Электронная» дырка, возникшая при фотоокислении хлорофиллов, заполняется электроном.

В дальнейшем образующийся НАД·Н2 и синтезированные путем фотофосфориллирования молекулы АТФ используется в цикле Кальвина (темновая фаза фототосинтеза), где происходит ассимиляция СО2.

Своеобразный механизм использования световой энергии обнаружен у экстремальных галофильных архебактерий родов Halobacterium и Halococcus. Галобактерии обитают в водах соленых озер или местах добывания соли путем выпаривания, в высококонцентрированных или насыщенных растворах солей.

В мембранах этих бактерий присутствует много каротиноидных пигментов (например, бактериоруберин), что придает колониям розовую или красную окраску. При недостатке в среде О2 в мембранах галобактерий синтезируется хромопротеид бактериородопсин пурпурного цвета.

Поглощая свет с максимумом длины волны 570 нм, бактериородопсин действует как особая разновидность протонного насоса, создающего градиент концентрации водородных ионов между наружной и внутренней сторонами мембраны, что приводит к синтезу АТФ. Энергия света используется в условиях низкой концентрации О2. В темноте при достаточном снабжении кислородом галофильные бактерии получают энергию в процессе дыхания. Источником углерода для галобактерий служат органические вещества, т.е. по типу питания галобактерии относятся к гетеротрофам. На свету они могут осуществлять фотогетеротрофный метаболизм, в темноте – хемогетеротрофный.

Хемосинтез – процесс образование органических соединений из неорганических за счет энергии окислительно-восстановительных реакций соединений азота, железа, серы. Хемосинтез характерен только для небольшой группы архей и бактерий (серобактерии, нитрофицирующие бактерии, железобактерии, водородные бактерии). У хемоавтотрофов отсутствуют фотосинтетические пигменты и они способны усваивать углерод не только из углекислого газа, но из других соединений (уксусной кислоты, карбонатов, метанола, муравьиной кислоты, угарного газа).


ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ