Методы культивирования микроорганизмов
Получение чистой культуры микроорганизмов
Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов
Рост бактерии – это увеличение массы и размеров ее клетки в результате скоординированного увеличения всех химических компонентов клетки. При этом изменения количества клеток в популяции (культуре) не происходит. При достижении определённых размеров клетка делится.
Размножение бактерии – это деление клетки и увеличение количества особей. Размножение бактериальных клеток ведет к росту популяции (культуры) микроорганизмов.
Рост популяции бактерий – это процесс увеличения размеров клеток и их количества.
В подходящей питательной среде, к которой бактерии полностью адаптированы, они находятся в состоянии сбалансированного роста. В период сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров популяции, например, количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды, т.е. сохраняют постоянный химический состав.
В культуре, растущей сбалансированно, скорость прироста вещества клеток в любой данный момент пропорциональна числу или массе имеющихся в это время бактерий.
Удельной скоростью роста (µ), или коэффициентом пропорциональности, называют отношение прироста биомассы (Δх) за 1 ч к исходной биомассе бактерий (х):
µ = Δх / t·1 / x,
где Δх – прироста биомассы, t – время культивирования, х – исходная биомасса
|
Данная величина отличается для разных культур, и даже для одной культуры.
Зная удельную скорость роста, можно определить время генерации (g) – время, необходимое для удвоения числа клеток популяции:
g = 1 / µ
|
Если рост клеток в культуре ограничен количеством внесенного в питательную среду компонента, то между его начальной концентрацией и полученной биомассой клеток существует постоянная линейная зависимость (при условии ограничения роста только по одному параметру). Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды, представляет собой величину, которую называют экономическим коэффициентом (y):
y = (x– x0) / (so– s),
где x – масса сухого вещества клеток в 1 мл культуры, вступившей в стационарную фазу роста; x0 – масса сухого вещества клеток в 1 мл среды сразу после инокуляции среды; (x – x0) – урожай бактериальной культуры (урожай зависит от количества и природы используемых питательных веществ, а также от условий культивирования); (so – s) – количество потребленного субстрата
|
В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).
Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет S-образную форму (рисунок 1).
Рост бактерий в периодической (статической) культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательные вещества и не удалять конечные продукты метаболизма, то получается так называемая периодическая культура – популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве.
Рисунок 1 – Кривая роста бактериальной популяции в статической культуре
На кривой различают фазы роста, сменяющие друг друга в определенной последовательности:
– лаг-фаза (начальная фаза) – промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления.
В клетках бактерий в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования (составу среды, температуре, pH и т.п.). Во время лаг-фазы деления клеток почти не происходит, отмечаются лишь процессы, подготавливающие клетку к размножению;
– экспоненциальная фаза – характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью роста. Во время экспонециальной фазы все клетки в популяции имеют приблизительно одинаковый размер, содержат максимальное количество РНК, количество белка в них также максимально и постоянно. Во время экспоненциальной фазы клетки наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью;
– стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. Из-за недостатка субстрата, вследствие высокой плотности бактериальной популяции, накопления продуктов метаболизма, а также при низком парциальном давлении кислорода, по причине накопления токсичных продуктов обмена и т. п. снижается скорость роста культуры микроорганизмов. Переход в стационарную фазу включает период несбалансированного роста, когда компоненты клеток синтезируются с различными скоростями, соответственно и содержание отдельных химических веществ в клетках на разных стадиях отличается. Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к физическим и химическим воздействиям;
– фаза отмирания характеризуется экспоненциальным снижением числа живых клеток.
В условиях непрерывного (проточного) культивирования в сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет на длительное время задержать культуру в состоянии экспоненциального роста.
Проточное культивирование осуществляется в биореакторах двух типов: хемостатах и турбидостатах. Хемостат состоит из культиватора, в который с заданной постоянной скоростью поступает питательная среда. Для равномерного и полного смешения питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Избыточная биомасса клеток с питательной средой вытекает из культиватора через сливной сифон в приемный сосуд. В хемостате прирост биомассы прямо пропорционален скорости притока субстрата и удаления продуктов метаболизма (рисунок 2 А).
Рисунок 2 – Схемы биореакторов для проточного культивирования микроорганизмов:
А – хемостат; Б – турбидостат; 1 – поступление среды; 2 – мешалка; 3 – сток культуры; 4 – насос; 5 – фотоэлемент; 6 – источник света
Турбидостат представляет собой ферментер, в котором автоматически поддерживается заданная плотность клеток за счет определения оптической плотности среды культивирования (рисунок 2 Б). Когда количество биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, что фиксируется фотоэлементом, соединенным с системой реле, включается подача свежей питательной среды.
При изучении обменных процессов применяют синхронные культуры микроорганизмов, т.е. культуры в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно. Для синхронизации клеточного цикла на клетки воздействуют температурой, светом, ограничением количества питательных веществ, колибровкой клеток посредством фильтрации и т.п.
Культивирование иммобилизированных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии: в производстве ценных органических веществ, в деградации токсичных природных и неприродных соединений, а также промышленных отходов, для очистки сточных вод от загрязнений. Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. При этом клеточные ферменты более стабильны, чем в выделенном состоянии. Однако клеточные стенки имеют низкую проницаемость для субстратов. Существуют два принципиально различных подхода к иммобилизации: физические и химические (рисунок 3).
Рисунок 3 – Методы иммобилизации клеток:
1 – адсорбция; 2 – включение в гель; 3 – инкапсулирование;
4 – включение в липосомы; 5 – ковалентное связывание
Физические методы иммобилизации реализуются в результате адсорбции микроорганизмов на поверхности различных нерастворимых синтетических или природных пористых материалов без образования ковалентной связи между клеткой и носителем (адсорбция на пористых поверхностях, включение в гель; инкапсулирование; включение в липосомы). Например, при смешивании суспензии клеток с раствором полимера (полиакриламид, агароза и т.п.) с последующей полимеризацией образуется пространственная структура геля с включенными в его ячейки клетками микроорганизмов. В результате микроорганизмы оказываются заключенными в ячейки, которые ограничивают их перемещение, но не препятствуют поступлению питательных веществ и осуществлению каталитических реакций. Полимерный носитель с клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают питательный раствор. В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, казеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом облегчается выделение продуктов биосинтеза.
Химические методы иммобилизации предполагают образование ковалентной связи между какой-либо из функциональных групп на поверхности клетки микроорганизма и материалом носителя. Химические методы применяются сравнительно редко, так как клетки в этом состоянии могут терять нужную активность.
Для культивирования микроорганизмов применяют питательные среды, которые являются одновременно и местом обитания микроорганизмов, и источником питательных веществ. Питательные среды по составу делятся на натуральные, синтетические, полусинтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. К средам такого типа относятся овощные или фруктовые соки, ткани животных, молоко, отвары мяса, вытяжки почвы, различные части растений, клетки микроорганизмов. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и малопригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей.
Синтетические среды – это среды, в которые входят соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Они широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов.
Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава
– углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и др. Однако в них всегда включаются вещества
неопределенного состава, такие как дрожжевой, почвенный, кукурузный экстракт или гидролизат казеина. Эти
среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов,
антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроор-
ганизмов.
По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие, плотные питательные среды.
Жидкие среды применяют для накопления биомассы или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби и др.
Плотные среды используют для выделения чистых культур, определения количества жизнеспособных микроорганизмов, хранения культур в коллекциях, для накопления биомассы. В целях уплотнения сред применяют гелеобразные вещества: агар (2–3 %), желатин (10–15 %) или силикатгель. Эти компоненты добавляют к жидким питательным средам, например, к мясопептонному бульону (МПБ), получая, таким образом, мясопептонный агар (МПА).
По назначению питательные среды подразделяют на элективные и дифференциально-диагностические.
Элективные (избирательные, накопительные) питательные среды предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Элективная среда по химическому составу и физическим свойствам обеспечивает преимущественное развитие определенной физиологической группе микроорганизмов. Избирательность создается температурными условиями, рН среды, добавлением антибиотиков и т. д.
Дифференциально-диагностические среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других и выявить некоторые их особенности. Эти среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации микроорганизмов. Дифференциально-диагностические среды (среда Гисса, среда Эндо, среда Левина и др.) содержат индикатор, меняющий свой цвет при изменении рН в результате расщепления ферментами углеводов питательных сред.
Питательные среды, применяемые для выращивания микроорганизмов, должны быть стерильными, содержать все необходимые для роста микроорганизмов компоненты, иметь оптимальные значения рН, окислительно-восстановительного потенциала, осмотического давления и т.д.
Популяции микроорганизмов, выделенные из природных источников, являются смешанными популяциями, т.е содержат несколько видов микроорганизмов. Для работы в лаборатории или использовании на производстве необходимы чистые культуры микроорганизмами. Чистой культурой является выращенная масса клеток одного вида микроорганизмов. Микроорганизмы чистых культур широко используются в технологии производства многих пищевых продуктов (кисломолочные сыры, хлеб, вино, пиво и т.д.).
Получение чистой культуры микроорганизмов включает три этапа:
1. Получение элективной (накопительной) культуры, которая состоит преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов или из клеток близких физиологических групп микроорганизмов.
На элективной питательной среде создаются условия, обеспечивающие преимущественное развитие выделяемых микроорганизмов, что позволяет изолировать их от многих сопутствующих. Элективные условия создаются путем подбора соответствующих питательных сред, регуляцией температуры, тепловой и ультрозвуковой регулировкой, использованием токсических веществ и т.д.
2. Выделение чистой культуры. Чистые культуры микроорганизмов, как правило, выделяют внутри или на поверхности плотных питательных сред (метод Р. Коха). Метод заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии, выросшей на плотной питательной среде в результате размножения одной клетки. Метод основан на том, что при нанесении микроорганизмов из посевного материала на плотную среду отдельные клетки будут закрепляться (иммобилизироваться) в определенной точке твердой среды и, размножаясь, давать потомство (клон), представляющее чистую культуру микроорганизма.
Для получения изолированных колоний исследуемый материал высевают на поверхность плотной питательной среды, нанося петлей или пипеткой. Дальнейший рассев проводят либо методом истощающего мазка, либо методом истощающего штриха (количество микроорганизмов, вносимых последовательно будет уменьшаться).
3. Определение чистоты выделенной культуры осуществляется при помощи визуального или микроскопического контроля, либо посевом на плотные питательные среды.
Визуальный контроль проводят тогда, когда выделенная культура микроорганизмов высеяна на поверхность скошенного агара. Если культура чистая, то характер ее роста на скошенном агаре однороден по всему штриху. Если штрих не однороден, то культура считается загрязненной.
Микроскопический контроль проводят на фиксированных окрашенных микропрепаратах. Чистая культура, как правило, морфологически однородна, допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток (исключение, полиморфные бактерии).
Посев на плотные питательные среды подразумевает, что культуру, подлежащую рассеву, пересевают в пробирку со свежей скошенной средой. Затем готовят суспензии этой культуры смывом стерильной водой. Взвесь микроорганизмов из последнего разведения рассеивают на поверхность плотных сред. Однородность роста колоний и совпадение их признаков с характеристиками вида свидетельствует о чистоте культуры.
Микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, поэтому существуют различия в способах их культивирования. Культивирование аэробных микроорганизмов проводят на поверхности плотных питательных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При культивировании аэробных микроорганизмов в жидких средах (глубинное культивирование) расходуется растворенный в среде кислород.
При культивировании анаэробных микроорганизмов необходимо свести контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом среды к минимуму. Для создания анаэробных условий используют три группы методов:
– физический метод – культивирование в микроанаэростате, т.е. приборе, в котором воздух замещен газовой смесью;
– химический метод – предполагает использование либо химических веществ, поглощающих молекулярный кислород (металлическое железо, дитионит натрия и др.), либо введение восстанавливающих агентов, которые снижают окислительно-восстановительный потенциал среды (аскорбиновая кислота, цистеин и др.);
– биологический метод включает: совмествое культивирование аэробов и анаэробов в закрытом культиваторе, где рост анаэроба возможен только после полного использования кисларода аэробом; культивирование в толще плотной среды; культивирование в вязких средах и т.п.