Занятие 6: Окраска спор


Лабораторная работа. Метод окраски спор по Цилю


В мазках бактериальных культур, находящихся на поздних стадиях спорообразования, часто фиксируются споры, находящиеся за пределами клеток.

Оболочка спор устойчива к действию большинства химических веществ, поэтому плохо прокрашивается. Чтобы споры прокрасились, препарат обрабатывают (протравливают) кислотой, затем окрашивают концентрированным раствором красителя при высокой температуре. При этом оболочки спор так прочно адсорбируют краску, что не обесцвечиваются при последующей обработке кислотой.

Таким образом, окраска спор производится по следующему плану: протравливают препарат кислотой, затем прокрашивают его, затем вновь обрабатывают кислотой, обесцвечивая вегетативные тела, и, наконец, окрашивают вегетативные тела в дополнительный контрастный цвет.


Материалы и оборудование: молодые 24–48-часовые культуры Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus (бациллярный тип спороношения), Clostridium pasteurianum (клостридиальный тип), каболовый фуксин Циля, раствор метиленовой сини Лефлера либо раствор метиленовой сини 1:40, 5 % серная кислота, комплект оборудования для микроскопирования, полоски фильтровальной бумаги.


Ход работы


1. Мазок из культуры Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Clostridium pasteurianum или другой спороносной бактерии подсушивают и наносят на него 5 % раствор хромовой кислоты (подогревают 5 минут до появления паров). При отсутствии хромовой кислоты можно нанести на мазок 1–2 капли 0,5 % раствора соляной кислоты и подогреть 1–2 минуты над пламенем горелки (до появления паров).

2. Кислоту сливают, мазок промывают водой, высушивают и фиксируют, пронося препарат 3–4 раза над пламенем спиртовки.

3. Охлажденный фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги и заливают раствором карболового фуксина Циля. Красят в течение 7 минут, подогревая препарат до появления паров. Необходимо следить, чтобы препарат не подсыхал. По мере испарения краситель добавляют, не давая препарату подсохнуть.

4. Краситель тщательно смывают водой.

5. На препарат наносят 5 % раствор серной кислоты на 20–40 секунд, после чего сразу промывают водой. При этой операции протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными.

6. На промытый препарат на 2–3 минуты наносят 2–3 капли метиленовой сини Лефлера. При отсутствии метиленовой сини Лефлера можно использовать раствор метиленовой сини 1:40 в течение 5–10 минут.

7. Препарат промывают водой, а затем просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с объективом ×40 или ×90 (с иммерсией).

На препаратах споры будут окрашены в красный цвет, а клетки – в голубой (рисунок 41).


Рисунок 41 – Типы спорангиев у Clostridium:

А – бациллярный; Б – клостридиальный; В – плектридиальный