Вирусы – это автономные генетические структуры, способные функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках бактерий, грибов, растений, животных, используя их генетический и белоксинтезирующий аппарат.
Для вирусов характерны две стадии жизненного цикла:
– вирион – внеклеточная, покоящаяся стадия, представленная целой вирусной частицей, состоящая в основном из белка и нуклеиновой кислоты;
– вегетативный вирус – внутриклеточная, вегетативная, репродуцирующаяся стадия.
Наиболее распространенные гипотезы происхождения вирусов:
1. Вирусы являются потомками древних, доклеточных форм жизни –протобионтов, предшествовавших появлению клеточных форм жизни, с которых и началась биологическая эволюция. После появления клеточной формы жизнивирусы перешли к паразитическому образу жизни.
2. Вирусы являются результатом крайнего проявления регрессивной
эволюции (деградации, упрощения) бактерий или других одноклеточных организмов.
3. Вирусы являются производными генетических элементов клеток, ставших автономными. Предками, которые дали начало большому разнообразию генетического материала у вирусов, являются генетические структуры схожие с плазмидами и транспозонами.
Вирусам характерен ряд уникальных свойств:
1. Фильтруемость вирусов – вирионы обладают способностью проходить через бактериальные фильтры, т.е. размеры вирусных частиц меньше размеров бактериальных клеток. Размеры вирусов колеблются от 25–30 нм до 350–400 нм.
2. Отсутствие клеточного строения – простейший вирион состоит из белкового капсида и нуклеиновой кислоты (вирус табачной мозаики, аденовирусы).
3. Наличие одного типа нуклеиновой кислоты в составе вириона.
У вирусов в качестве геномной нуклеиновой кислоты может выступать как ДНК, так и РНК. К ДНК-геномным
вирусам относятся аденовирусы, герпесвирусы, гепаднавирусы и др., к РНК-геномным – ретровирусы,
ортомиксовирусы, рабдовирусы и др.
4. Вирусы неспособны размножаться на искусственных питательных средах, т. е. вне клетки. Из-за отсутствия собственных белок-синтезирующих систем, вирусы являются генетическими паразитами и их воспроизводство возможно лишь в клетке.
5. Отсутствие способности к росту и бинарному делению – воспроизводство вирусов носит дизъюнктивный характер, т. е. различные компоненты вируса синтезируются независимо в разных частях клетки-хозяина, а затем собираются в единый вирион.
Вирионы простых вирусов представляют собой нуклеокапсид, включающий капсид и нуклеиновую кислоту. У сложных вирусов вирион имеет нуклеокапсид и суперкапсид – дополнительную внешнюю оболочку (рисунок 30). Большинство патогенных для человека вирусов сложноустроены (ВИЧ, вирус гриппа, вирус клещевого энцефалита, вирус бешенства и т.д.).
Капсид вирионов состоит из белковых капсомеров уложенных по принципам геометрической симметрии. Белковый капсид защищает нуклеиновую кислоту вируса от воздействия физических, химических факторов, клеточных нуклеаз. В зависимости от укладки капсомеров капсиды могут иметь различный тип симметрии:
Рисунок 30 – Строение вирионов:
А – вирус табачной мозаики; 1 – РНК; 2 – капсомеры; 3 – капсид; Б – ВИЧ
– спиральные капсиды имеют вид нити, бациллы, пули (например, капсид вируса табачной мозаики, капсид ВИЧ);
– икосаэдрические, или кубические, капсиды имеют вид многогранника (например, аденовирусы человека и животных);
– капсиды со смешанным типом симметрии характерны для
Т-четных бактериофагов, которые имеют головку в виде многогранника,
а отросток в виде спирали.
Суперкапсид (пеплос)состоит из двух липидных слоев, в которые погружены молекулы специфических белков – шипиков (пепломеров). У большинства вирусов шипики представляют собой гликопротеиды. Напрпимер, суперкапсид ВИЧ несет на себе шипики, состоящие из двух гликопротеидов – GP120 и GP41, у вируса гриппа два типа шипиков – гемагглютинин (H) и нейраминидаза (N). Шипики выполняют роль прикрепительных белков на поверхности чувствительных клеток. Поэтому при их удалении вирус полностью теряет инфекционную активность.
Репродукция вирусов – процесс воспроизводства вирионов в чувствительных клетках (рисунок 31).
Цикл репродукции вирусов включает четыре стадии:
1. Адсорбции вируса на рецепторах чувствительных клеток осуществляется за счет прикрепительных белков-шипиков.
2. Проникновение вируса в клетку реализуется за счет двух механизмов:
– виропексис – вирус проникает в клетку путем инвагинации участка цитоплазматической мембраны с
образованием вокруг нее вакуоли –
эндосомы;
– проникновение за счет слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной. Встречается лишь у тех видов вирусов, которые имеют белки слияния в капсидах простых и суперкапсидах сложных вирусов. Например, парамиксовирусы содержат F-белок слияния, который вызывает образование многоядерных симпластов и синтициев в однослойных культурах клеток.
3. Стадия депротеинизации вируса в клетке – предусматривает освобождение вирусных нуклеиновых кислот от оболочек. Осуществляется за счет ферментов поверхностных мембран клеток (при слиянии вирусных оболочек и клеточной мембраны), или ферментов лизосом, внутриклеточных цитоплазматических и ядерных мембран (при виропексисе). Конечными продуктами депротеинизации вирусов являются нуклеиновые кислоты с внутренним вирусным белком (пикорнавирусы, аденовирусы), нуклеокапсидом (ортомиксовирусы) или сердцевиной (аденовирусы).
Рисунок 31 – Схема цикла репродукции вирусов
4. Стадия биосинтеза компонентов вируса – образования вирусных белков и нуклеиновых кислот в клетке за счет синтетического аппарата клетки. Стадия включает фазы транскрипции, трансляции и репликации, у разных групп вирусов и семейств неодинакова и зависит от типа геномной нуклеиновой кислоты.
Способ репродукции вирусов называют дизъюнктивным, или разобщенным, поскольку вирусные компоненты синтезируются неодновременно и в разных местах клеток.
5. Самосборка вирионов осуществляется за счет самопроизвольного механизма белок-нуклеинового узнавания. Сборка вирусных компонентов начинается всегда с формирования нуклеокапсидов (сердцевина) и синтеза суперкапсидных белков. У сложных вирионов сборка происходит поэтапно и зависит от места репликации (в цитоплазме или ядре).
6. Выход зрелых вирусных частиц из клетки может осуществляться двумя путями:
– взрывной путь характерен для простых вирусов и осуществляется за счет лизиса клеток (аденовирусы, большинство бактериофагов и др.);
– выход путем отпочковывания от клеточных мембран присущсложным вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку (ортомиксовирусы, парамиксовирусы, ретровирусы и т.д.). Вирионы покидают клетку постепенно, при этом жизнеспособность клетки сохраняется. Нуклеокапсиды покрываются суперкапсидом – участком модифицированной липидной клеточной мембраны.
Различают три основных метода культивирования вирусов:
1. Метод культивирования возбудителей болезней в организме восприимчивых лабораторных животных (биологический метод, in vivo) впервые был применен Л. Пастером. В качестве лабораторных животных чаще всего применяют белых мышей, хомяков, морских свинок, кроликов. В последние годы применяют новорожденных животных, животных чистых линий с известной наследственностью. Лабораторные животные должны быть в достаточной степени восприимчивы к инфекции испытуемым вирусом, не должны нести в себе латентной инфекции или каких-либо паразитов. Обычно в опыт берут животных одного вида и возраста и содержат их в одинаковых условиях.
Перед заражением всех животных выдерживают на карантине в течение 2–3 недель. Метод заражения подопытных животных подбирают с учетом тропизма культивируемого вируса (нейротропные, пневмотропные, пантропные, дерматропные вирусы и т. д.).
При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, тогда патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. Также у животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных.
2. Метод культивирования вирусов на куриных эмбрионах был предложен в 1931 г. Э. Гудпасчером. К преимуществам метода относится: наличие плотной скорлупы, надежно защищающей внутреннее содержимое от микроорганизмов; достаточная жизнеспособность эмбрионов и устойчивость к внешним факторам; отсутствие у эмбрионов антител и восприимчивость ко многим группам вирусов; возможность получить больший выход вируссодержащего материала.
В эксперимент отбирают крупные, чистые, но немытые, оплодотворенные яйца белых кур, содержащие
жизнеспособные эмбрионы
7–12-дневного возраста. Метод заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса. Различные
виды вирусов удается репродуцировать в строго определенных отделах куриного эмбриона: вирус гриппа – в
амнионе и аллантоисе, вирусы герпеса и бешенства – в желточном мешке, вирус натуральной оспы – в
хорионаллантоисной оболочке.
Перед заражением при овоскопировании отмечают на скорлупе границы воздушного мешка и место расположения эмбриона. Заражают в асептических условиях, используя стерильные инструменты. Эмбрионы содержат в термостате при температуру 37 ºС и 60 % влажность. Ежедневно просматривают развитие эмбрионов под овоскопом.
Результаты заражения проявляются в виде гибели эмбриона, дефектов развития, накопления вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования) и т. д.
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах является наиболее доступным и удобным методом для первичного выделения вирусов от больных животных и из объектов внешней среды, для последующего культивирования вирусов в лаборатории. Метод широко применяется для идентификации вирусов и антител, а также для приготовления вакцин и диагностикумов.
3. Метод размножения вирусов в культуре клеток был разработан П. Эндерсом в 1949 г. на примере вируса полиомиелита.
Культура клеток – это выращенные вне организма (in vitro) на питательных средах клетки различных тканей животных и человека, сохраняющие присущие им обмен и восприимчивость к определенным вирусам.
Все типы культур клеток выращивают при температуре 36–37 ºС в ультратермостатах. Интенсивное деление клеток, адсорбирующихся на поверхности стекла, приводит к образованию в течение 5–7 суток клеточного монослоя. Материал, в котором подозревают наличие вируса (лизат бактерий, кусочки ткани, биологическая жидкость) при необходимости измельчают, гомогенезируют, приводят в состояние суспензии. При этом большие фрагменты клеток, загрязняющие материал, микроорганизмы удаляют центрифугированием или фильтрацией. Такую суспензию наносят на монослой клеток. Зараженный монослой покрывают агаровым покрытием. Контролируют рост клеток под малым увеличением микроскопа, начиная с 3–4 дня.
О репродукции вирусов в культуре ткани судят по их цитопатическому действию, которое проявляется в виде гибели клеток и образования бляшек (стерильные пятна); округлении и сморщивании клеток; слиянии клеток и образовании многоядерных гигантских клеток и симпластов; появлении в клетках включений (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гамагглютины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гамадсорбция).
Бактериофаги – вирусы, поражающие бактерии. Фаги обнаруживаются во всех объектах окружающей среды – в воде, почве, молоке, в различных выделениях человека и животных и т. п.
Вирионы бактериофагов представляют собой нуклеокапсиды. В зависимости от структуры белкового капсида выделяют пять морфотипов бактериофагов (рисунок 32).
Рисунок 32 – Морфотипы бактериофагов:
А – нитевидные; Б – головчатые с аналогом отростка; В – головчатые фаги с коротким отростком; Г – головчатые фаги с длинным несокращающимся чехлом отростка; Д – головчатые фаги с длинным сокращающимся чехлом отростка
У наиболее сложно строенного Т2 Coli-фага различают: шестигранную головку, воротничок, отросток, состоящий из полого стержня, снаружи покрытого сократительным чехлом; шестиугольную базальную пластинку с зубцами и нитями (рисунок 33).
Рисунок 33 – Строение Т2Coli-фага
Большинство бактериофагов являются ДНК-геномными.
РНК-геномные фаги встречаются только в группе головчатых фагов с аналогом отростка (содержат
одноцепочечную линейную РНК).
Резистентность (устойчивость) фагов к факторам окружающей среды достаточно велика. Они
выдерживают нагревание до 75 ºС,
не обезвреживаются в малых концентрациях дезинфицирующих веществ, резистентны к антибиотикам, хлороформу
и ферментным ядам. Быстро разрушаются фаги в желудочном соке, а также под воздействием ультрафиолетовых
лучей, ионизирующих излучений.
Фаги по характеру взаимодействия с бактериями подразделяются на вирулентные и умеренные с полноценным и дефектным геномами. Взаимодействия вирулентного фага с бактерией проходит по литическому пути, т. е. сопровождается размножением вирионов и лизированием клеток. Взаимодействие умеренных фагов с клеткой проходит по литическому или лизогенному пути
Трансдукция – вид рекомбинации генетического материала, при которой перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту осуществляют умеренные дефектные бактериофаги.
Трансдукцию у бактерий открыли лауреаты Нобелевской премии Д. Ледерберг и Н. Циндер.
Взаимодействие умеренного фага с бактерией может осуществляться по литическому и лизогенному пути (рисунок 34).
При литическом пути взаимодействия фаговый геном в клетке остается в автономном состоянии и осуществляется продуктивная инфекция, фаг репродуцируется, клетка лизируется.
Рисунок 34 – Пути взаимодействия умеренного фага с клеткой:
А – литический путь: 1 – бактериальная ДНК; 2 – фаговый капсид; 3 – фаговый геном; 4 – вирусные белки; 5 – копии фагового генома; 6 – сборка фаговых частиц; 7 – лизис клетки;
Б – лизогенный путь: 1 – проникновение фаговой ДНК в клетку;
2 – интеграция; 3 – профаг в ДНК клетки
Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции. С частью бактерий умеренные фаги вступают в симбиоз, т. е. осуществляют лизогенный путь взаимодействия. При лизогенном пути взаимодействия происходит интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и переход фага в профаг. Профаг – умеренный фаг, геном которого объединился с геномом бактерии-хозяина. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией. Культура бактерий, содержащая профаг, является лизогенной.
Фаговая конверсия – изменение свойств бактерий под влиянием профага. В состоянии лизогенности у бактерий появляются новые признаки и свойства, кодируемые геномом фага (изменяются форма колоний, цвет колоний, токсигенность штаммов, появляются новые антигенные детерминанты и т. д.). Лизогенные культуры невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом.
Поскольку лизогенные клетки продолжают размножаться, то профаг при размножении клетки реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, поэтому наследуется всеми дочерним клеткам.
Связь профага с геномом бактерии достаточно прочная и в естественных условиях нарушается с частотой 10–2–10–5 (спонтанная продукция фага). Частоту отщепления профага от бактериальной хромосомы может увеличить воздействуя на лизогенные бактерии ультрафиолетовыми лучами, ионизирующей радиацией и химическими мутагенами (индукция лизогенных бактерий).
В некоторых случаях при переходе из интегрированного состояния в вегетативную форму в профаг включаются гены бактерий (обычно часть фаговой ДНК, которая остается в геноме бактериальной клетки, замещается бактериальными генами). Утратившие часть своего генома умеренные дефектные фаги осуществляют перенос генов – трансдукцию.
Различают три типа трансдукции:
1. Общая (генерализованная) трансдукция осуществляется фагами с множественной локализацией на бактериальной ДНК (Ми-1). При этом фагом переносятся любые гены, объем которых равен длине утраченного фрагмента фаговой ДНК. Генерализованная трансдукция возникает с низкой частотой – 10–4–10–7 на одну фаговую частицу.
2. Специфическая (ограниченная) трансдукция осуществляется фагами, обладающими избирательной локализацией на бактериальной ДНК и способными переносить ограниченное число генов, прилегающих к специфическим участкам интеграции (λ, Р2, р22). Фаг λ (лямбда) интегрирует с геномом кишечной палочки в районе галактозного локуса, а поэтому может переносить только один из прилегающих к зоне встраивания ген (gal или bio).
3. Абортивная трансдукция представляет собой вариант общей трансдукции, при котором перенесенный фагом фрагмент ДНК клетки-донора остается в цитоплазме клетки-реципиена в автономном состоянии. Абортивная трансдукция встречается в 10 раз чаще общей трансдукции.
С помощью трансдуцирующего фага могут передаваться как единичные гены, так и сцепленные маркеры,
проявляющиеся в фенотипе в виде таких признаков и свойств, как способность сбраживать различные
углеводы, синтезировать аминокислоты и витамины, резистентность к антибиотикам, вирулентность,
токсигенность, жгутики. Образующиеся рекомбинанты называются трансдуктантами. Приобретенные в
процессе
трансдукции признаки стабильны и передаются по наследству.
Трансдукция обнаружена у многих видов бактерий: Escherichia соli, Shigella,
Salmonella, Vibrio cholerae, Proteus, Staphylococcus,
Enterococcus
и др. Чаще удается внутривидовая трансдукция, т. е. фаговый перенос генетического материала в пределах
определенного вида бактерий. Большой интерес представляют данные о межвидовой трансдукции и особенно о
возможности этого вида рекомбинаций в природных условиях. Трансдукция служит активным механизмом
формирования культур с измененными свойствами и может играть большую роль в эволюции микробов.
К основным направлениям практического применения бактериофагов относятся:
– фаготерапия и фагопрофилактика при различных бактериальных инфекциях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.);
– фагодиагностика позволяет идентифицировать бактерии с помощью соответствующего фага, поскольку типовые фаги избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида;
– в качестве переносчиков генов между бактериями в генной инженерии, для конструирования направленных изменений в геноме клетки.
Помимо типичных вирусов различают две группы вирусоподобных агентов – вироиды и прионы.
Вироиды – инфекционные частицы, представленые низкомолекулярными однонитевыми молекулами РНК, лишенными белковой оболочки. Открыты вироиды в 1971 г. американский фитопатолог Т. Диннером при изучении инфекционного заболевания картофеля «веретеновидность клубней». Вироиды представляют собой ковалентно замкнутые кольцевые одноцепочечные молекулы длиной от 246 до 467 нуклеотидов. Ковалентно замкнутая кольцевая РНК вироидов существует в виде палочковидной формы из-за спаривания азотистых оснований внутри цепи, в результате чего образуются двухцепочечные участки с одноцепочечными петлями. Вироиды обнаруживаются в ядрышке, хлоропластах инфицированной клетки. Одновременно может присутствовать от 200 до 100 тыс. копий генома вироида. РНК вироидов не кодирует каких-либо белков, поэтому вироиды используют ферментные системы клетки-хозяина. Предполагается, что для этих целей они используют ДНК-зависимую РНК-полимеразу хозяйской клетки – фермент, который обычно используется для синтеза РНК на матрице ДНК. Размеры вироидов находятся в пределах 15 нм. Пути передачи, характер поражения и меры борьбы при вирусных и вироидных инфекциях у растений сходны.
![]() |
![]() |
Т. Диннер 1921 г.р. |
С. Прузинер 1942 г.р. |
Прионы как новая форма биологического инфекционного агента была открыта в 1982 г. С. Прузинером. Прионы – белковые инфекционные агенты, не содержащие нуклеиновую кислоту. Прионы представлены низкомолекулярными белковыми частицами из класса сиалогликопротеидов. Полипептидные цепи прионов состоят из 253–254 аминокислот, к боковым цепям которых прикрепляются остатки сахаров. Прионные белки имеют аномальную третичную структуру.
Прионный белок существует в двух формах:
– РrРс – неинфекционная клеточная форма прионного белка. Коди-руется клеточным геномом и обнаруживается в организмах всех млекопи-тающих. В нейронах РrРс участвует в передаче нервных импульсов, регу-лирует суточные ритмы;
– PrPSc – инфекционный прионный белок вызывает тяжелые заболевания центральной нервной системы и медленные инфекции.
Инфекционный прионный белок в организме может возникнуть спонтанно, вследствие мутации или попадает извне (с пищей, при медицинских манипуляциях, пересадке тканевых материалов и т.д.).
Процесс накопления инфекционного прионного белка обусловлен контактом исходного белка РrРс и инфекционного прионного белка PrPSc. В процессе взаимодействия инфекционный белок индуцирует в нормальном клеточном белке структурные (конформационные) изменения (α-спирали переходят в β-слои) и превращает его в инфекционную форму. Содержание инфекционного белка увеличивается в геометрической прогрессии. Прионы, как и вирусы, имеют ультрамикроскопические размеры и не культивируются на искусственных питательных средах. Прионы крайне устойчивы, инактивируются только при автоклавировании в течение 30 мин. при температуре 135 °С.
При прионных инфекциях развиваются губкообразные энцефолопатии. Прионные губкообразные энцефалопатии были зарегистрированы у различных видов млекопитающих (кошек, норок, мулов, оленей, лосей, антилоп). У человека к основным формам губкообразных энцефолопатий относятся болезнь Крейтцфельдта – Якоба, синдром Герстмана – Штраусслера-Шейнкера, фатальная семейная бессонница, болезнь Куру, у сельскохозяйственных животных – коровье бешенство, скрейпи у овец и коз.