Занятие 5: Окраска нуклеоида бактерий


Лабораторная работа. Метод окраски нуклеоида бактерий


Нуклеоид бактерий располагается в центральной зоне клетки в виде двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной наподобие клубка. Чаще в бактериальной клетке содержится одна хромосома, представленная кольцевой молекулой ДНК. При нарушении деления в ней может находиться 4 и более хромосом. На электронограммах ультратонких срезов бактерий нуклеоид имеет вид светлых зон с фибриллярными, нитевидными структурами ДНК, связанной определенными участками с цитоплазматической мембраной или мезосомой, участвующими в репликации хромосомы. Нуклеоид выявляется и в световом микроскопе после окраски специфическими для ДНК методами по Фельгену или по Романовскому–Гимзе.

В цитоплазме бактериальных клеток помимо кольцевой ДНК содержится много РНК, которая окрашивается ядерными красителями так же, как и ДНК. Поэтому предлагаемый метод обнаружения бактериальной ДНК настроен на устранение РНК цитоплазмы гидролизом мазка в соляной кислоте и последующей окраске ДНК.


Материалы и оборудование: молодые культуры микроорганизмов – Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Azotobacter chroococcum, 1 % раствор формалина, 40 % формалин, 0,1–1 % раствор фуксина, предметные стекла, спиртовка, чашка Петри с обрезками стекла, термометр, промывалки, водяная баня, стакан 50–100 мл с 1 н соляной кислотой.


Ход работы


1. Из суточной культуры микробов приготавливают суспензию и наносят мазок на предметное стекло.

2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют парами 40 % формалина и высушивают в течение нескольких секунд (или парами 2 % раствора осмиевой кислоты в течение 2–3 минут). Для фиксации мазка на дно чашки Петри наносят 2–3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают на обрезки стекла мазком вниз.

3. Мазок подвергают гидролизу в 1 % растворе соляной кислоте при температуре +60 ºС (2–3 минуты) и немедленно тщательно промывают мазок водой.

Гидролиз мазка проводят, погружая препарат в небольшой химический стакан с соляной кислотой, помещенный в водяную баню.

4. Затем мазок заливают 1 % раствором формалина на 1,5 минуты и вновь промывают водой.

5. Мазок окрашивают 0,1–1 % водным раствором основного фуксина на 1–2 минуты, промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют, пользуясь объективом ×100 (с иммерсией).

В препарате на розовом фоне цитоплазмы выделяется нуклеоид, окрашенный в ярко-малиновый цвет в виде образования неопределенной формы по центру клетки (рисунок 40 А) либо в виде двух тел, лежащих ближе к полосам (рисунок 40 Б).


Рисунок 40 – Bacillus subtilis:

А – нуклеоид в неделящихся клетках, Б – нуклеоид в делящихся клетках